Person: Brola, Tabata Romina
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Brola
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Tabata Romina
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Publication Estrategias reproductivas de moluscos gasterópodos: Caracterización de las defensas de los huevos de Pomacea scalaris y Pomacea diffusa (Caenogasteropoda: Ampullaridae)(Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo, 2021) Brola, Tabata Romina; Heras, Horacio; Dreon, Marcos SebastiánEl género Pomacea es el más derivado y con mayor número de especies dentro de la familia Ampullaridae. Está compuesto por caracoles nativos de América que han sido introducidos en otras partes del mundo donde, algunas de sus especies, se han convertido en una seria plaga para la agricultura. Además, representan un riesgo sanitario al ser hospedadores intermediarios de varios parásitos que pueden afectar a seres humanos. Estos caracoles dulceacuÃcolas tienen la particularidad de tener oviposición aérea, una adquisición que se ha reconocido clave para el éxito evolutivo del género. En esta inusual estrategia reproductiva, las hembras depositan sus huevos fuera del agua en masas calcáreas coloridas, exponiéndolos a desecación, radiación solar intensa, altas temperaturas y depredación, y sin embargo, las adaptaciones de estos huevos permiten a sus embriones desarrollarse normalmente bajo esas condiciones. Los huevos de Pomacea presentan un sistema de protección, tanto frente a factores ambientales como contra la depredación, probablemente el motivo de sus escasos depredadores reportados. Al igual que la mayorÃa de los gasterópodos, en Pomacea, el embrión se encuentra rodeado por un fluido perivitelino (FPV) que contiene principalmente hidratos de carbono y proteÃnas (llamadas perivitelinas) a partir de los cuales se nutre el embrión. Las perivitelinas, además, cumplen el rol de protección frente a factores externos. La más abundante del FPV, llamada PV1, es una carotenoproteÃna no digerible (antinutritiva) que disminuye el valor nutricional de los huevos, con propiedades antioxidantes y fotoprotectoras. Además, le otorga la coloración caracterÃstica a las puestas de cada especie, posiblemente una señal de advertencia o aposemática. La carotenoproteÃna de Pomacea scalaris, llamada PsSC, presenta además actividad lectina (proteÃnas que unen hidratos de carbono de manera especÃfica de variadas funciones). En los huevos de animales, las lectinas generalmente se han asociado a la protección contra microorganismos y en las plantas a la defensa contra la herbivorÃa. Esta actividad lectina está ausente en las demás carotenoproteÃnas estudiadas del género. Más aún, la composición del FPV varÃa entre especies: Pomacea canaliculata y Pomacea maculata, incluidas en el clado canaliculata, presentan una perivitelina neurotóxica ausente en P. scalaris que pertenece al clado hermano bridgesii. Coincidentemente, las especies del clado canaliculata son las que han alcanzado mayor expansión e invasividad en las áreas introducidas. Las diferencias observadas entre los huevos de los dos clados nos llevaron a cuestionarnos si existÃan mecanismos de defensa bioquÃmicos dependientes de la posición filogenética de las especies y en consecuencia a profundizar el conocimiento de las perivitelinas del clado bridgesii, hasta el momento pobremente estudiado. Por otra parte, se sabe que la administración oral de la fracción soluble de huevo (ESF) de P. canaliculata a roedores altera la morfofisiologÃa de su tracto digestivo y disminuye la tasa de crecimiento de estos animales, pero se desconoce el efecto de su administración en otros potenciales depredadores no mamÃferos, impulsándonos también a evaluar el efecto de su ingesta sobre el sistema digestivo de anfibios y aves. Para abordar estos objetivos, iniciamos los estudios caracterizando en profundidad la lectina PsSC y su rol en la defensa contra microorganismos y depredadores. Analizamos su estructura primaria y hallamos que las secuencias de las subunidades de esta lectina no tienen homologÃa con ninguna de las lectinas representadas en las bases de datos. Esta proteÃna solo presenta elevada similitud de secuencia con sus ortólogos del clado canaliculata aunque llamativamente estos no presenten actividad lectina. Evaluamos su especificidad de reconocimiento de hidratos de carbono mediante un microarreglo de glicanos observando que PsSC tiene elevada afinidad por dos motivos de oligosacáridos: gangliósidos y grupo ABO. También evaluamos su capacidad de aglutinar bacterias gram positivas y gram negativas observando que PsSC muestra capacidad para aglutinar estas últimas, pero carece de actividad antimicrobiana contra las cepas evaluadas. Además, evaluamos el efecto de su ingestión sobre el tracto digestivo de roedores donde observamos que afectaba la morfologÃa de las vellosidades del intestino, asà como el patrón de glicosilación y extensión de su epitelio absortivo. En conjunto, estos resultados indican que PsSC tendrÃa una doble función ya que estarÃa implicada en la protección del huevo tanto contra la invasión microbiana como contra depredadores mamÃferos. Continuando con el estudio de las perivitelinas del clado bridgesii, se analizaron los huevos de P. diffusa. Se aisló y caracterizó estructural y funcionalmente su perivitelina más abundante: una carotenoproteÃna a la que denominamos PdPV1. Se determinó su estructura primaria y nuevamente hallamos que está compuesta por polipéptidos que presentan homologÃa únicamente con otras secuencias del género Pomacea. PdPV1 presenta actividad lectina con caracterÃsticas estructurales y funcionales similares a las de PsSC y ausencia de homologÃa de secuencia con otras lectinas conocidas, excepto PsSC. PdPV1 es estable estructuralmente en un amplio rango de pH y temperaturas y soporta la digestión por proteasas in vitro e in vivo, siendo capaz de atravesar el tracto digestivo de ratones inalterada, indicando que es una proteÃna antinutritiva. En conjunto estos avances permitieron realizar las primeras generalizaciones de las PV1s de Pomacea demostrando que las carotenoproteÃnas del clado bridgesii presentan una novedosa actividad lectina ausente en los ortólogos del clado canaliculata. Además, el FPV de P. diffusa, al igual que el de P. scalaris, no presenta neurotoxinas. En conjunto estos resultados, indican que las defensas de los caracoles del género Pomacea son clado-especÃficas. Por último, se amplió el conocimiento sobre los posibles blancos de las defensas bioquÃmicas de los huevos, evaluando el efecto de la administración oral de la ESF sobre el tracto digestivo de un anfibio (la rana toro Lithobathes catesbeianus) y un ave (la codorniz Coturnix coturnix). Analizamos las alteraciones en la morfometrÃa de las vellosidades y los patrones de glicosilación intestinal, su superficie absortiva relativa y la histopatologÃa de los tejidos luego de 24 h y 48 h de la administración. Los resultados muestran que tanto anfibios como aves se ven afectados negativamente 24 h posteriores a la ingestión del extracto de huevo. En los anfibios administrados con ESF de P. canaliculata se observa un ensanchamiento de las vellosidades y engrosamiento de la lámina propia, asà como una leve hemorragia y presencia de células inflamatorias, mientras que en las aves administradas con ESF de una especie de cada clado, se vio afectada la morfometrÃa de las vellosidades, la superficie absortiva relativa del intestino y se observó edema e hiperemia de las vellosidades intestinales, independientemente de la ESF del clado empleado. En las ranas, se ensayó además la letalidad de la ESF por administración intraperitoneal, donde observamos que ningún animal resultó afectado tras este ensayo. Este resultado es llamativo ya que investigaciones previas han demostrado que la ESF de P. canaliculata es letal tanto para roedores como para codornices. Los resultados, en conjunto, demuestran que las defensas bioquÃmicas de los caracoles del género Pomacea no solo son efectivas frente a mamÃferos, sino también frente a aves y anfibios. En sÃntesis, con este trabajo de Tesis Doctoral avanzamos en el conocimiento de las defensas bioquÃmicas de los huevos de Pomacea en un contexto ecológico-evolutivo. Se demuestra que estas defensas antidepredador son clado-especÃfica y estarÃan relacionadas con el potencial de invasividad de las especies. Se demuestra también que estas defensas bioquÃmicas complejas resultan efectivas frente a una diversidad de animales potencialmente depredadores más amplia de lo que se conocÃa, donde perivitelinas indigeribles que afectan el sistema digestivo juegan un papel central. Desde el punto de vista evolutivo este mecanismo de protección de los huevos, único en animales, es muy similar al que utilizan las plantas como protección contra herbÃvoros, un caso de convergencia evolutiva, aunque, a diferencia de las plantas, estas defensas estarÃan aquà advertidas por la llamativa coloración de las puestas. Este inusual conjunto de defensas explicarÃa la casi ausencia de depredadores reportados para los huevos del género ampliando el conocimiento de las relaciones depredador-presa a nivel molecular.