Rol del ácido alfa lipoico durante el desarrollo embrionario preimplantacional de embriones de mamífero

Abstract

El desarrollo embrionario preimplantacional in vitro en mamíferos incluye tres etapas consecutivas: maduración in vitro (MIV), fecundación in vitro (FIV), y cultivo in vitro (CIV), y está influenciado por diferentes factores relacionados con el medio de cultivo así como por las condiciones, como las concentraciones de oxígeno (O₂) y dióxido de carbono (CO₂), la temperatura, el pH, la humedad, los aminoácidos (aa) y los factores de crecimiento. Por su parte, el sistema de producción de energía del embrión genera especies reactivas del oxígeno (ERO), las cuales están sensiblemente controladas por un balance del estado de óxido-reducción. Cuando sufre un desequilibrio, aumenta la producción de ERO, lo que ocasiona estrés oxidativo. Las consecuencias son varias, como daño en el ADN, detenimiento en el desarrollo embrionario temprano y apoptosis celular, entre otras. La incorporación de antioxidantes en el medio de cultivo para regular el microambiente intracelular y extracelular es importante para reducir la toxicidad de las EROs y mejorar el desarrollo embrionario in vitro. Se ha demostrado que en muchas especies, el ácido alfa lipoico (AAL) es esencial para el desarrollo embrionario. El AAL es sintetizado a partir del ácido octanoico y distintas fuentes de azufre, y tanto su forma oxidada (AAL) como reducida (ADHL) tienen conocida actividad antioxidante, actuando en condiciones in vivo e in vitro. Por lo expuesto, el objetivo general del presente trabajo de tesis doctoral fue investigar los efectos de la suplementación con AAL en el medio de CIV para el desarrollo in vitro de embriones bovinos. Para ello, se llevaron a cabo tres objetivos específicos. El primer objetivo (Capítulo 1) fue estudiar el efecto de diferentes concentraciones del AAL y condiciones de cultivo durante el CIV, evaluando parámetros de estrés oxidativo y capacidad de desarrollo de embriones preimplantacionales de bovino a partir de ovocitos de ovarios de matadero (Experimento 1 y 2). En en Experimento 1 se evaluaron la producción embrionaria y el estado oxidativo de embriones derivados de ovocitos de matadero, que se sometieron a las etapas consecutivas de MIV, FIV y CIV, cultivandose hasta la etapa de desarrollo de blastocisto utilizando diferentes concentraciones de AAL (5, 25 y 100 μM), suero fetal bovino (SFB), aa y 20 % de tensión de O₂ en la atmósfera de cultivo. En el Experimento 2, los embriones se cultivaron sin SFB, a diferentes concentraciones de AAL (2,5, 5 y 7,5 μM) y en presencia o ausencia de aa, en una atmósfera de 7 % de O₂. Se evaluaron las tasas de desarrollo embrionario y la calidad del blastocisto. En conjunto, los resultados indicaron que la suplementación con mayores concentraciones de AAL resultó en un deterioro del desarrollo del embrión, independientemente de la concentración de O2 impuesta durante el período de cultivo, mientras que las concentraciones de suplementación relativamente menores con AAL llevaron a mejoras en la calidad del embrión. El objetivo 2 (Capítulo 2) fue estudiar el efecto de la mejor condición de CIV obtenida en el Objetivo 1, evaluando la capacidad de desarrollo, estado antioxidante y calidad de los embriones obtenidos a partir de ovocitos de ovarios de matadero. Además, se investigó su efecto sobre la criotolerancia posterior a la vitrificación (Experimento 3). Los resultados demostraron que la suplementación con AAL en el CIV durante las primeras 24 h del cultivo (momento de la menor activación del genoma embrionario, estadio de 2 a 8 células (mAGE)) aumenta la formación de blastocistos, la tasa de blastocistos Grado 1, y la tasa de eclosión. Además, mejora la calidad del embrión en términos de número de células por blastocisto. Por otro lado, el AAL disminuye los niveles de EROs en blastocistos vitrificados y re-expandidos por calentamiento. El objetivo 3 (Capítulo 3) fue validar la mejor condición de CIV obtenida en el Objetivo 2 durante la AGE utilizando ovocitos de matadero y finalmente ovocitos recuperados de donantes vivas mediante la técnica de Ovum Pick Up (OPU) evaluando la capacidad de desarrollo embrionario temprano (Experimento 4 y Experimento 5). Se realizaron dos experimentos: el experimento 4 tuvo como objetivo evaluar los efectos del AAL en el desarrollo y la calidad embrionaria durante la mayor AGE (MAGE) (estadio de 8 a 16 células) utilizando ovocitos de matadero. El Experimento 5 tuvo como objetivo verificar si los resultados obtenidos de AAL en ovocitos derivados de matadero durante el AGE podían extrapolarse a los ovocitos derivados de OPU. Los experimentos demostraron que la suplementación con AAL en el medio de CIV durante la fase de MAGE podría ser una posible estrategia para mejorar la calidad embrionaria de los ovocitos derivados de OPU. Podemos concluir que la administración de AAL durante diferentes períodos de cultivo genera distintos efectos en el desarrollo embrionario de bovinos, tanto en la tasa como en la calidad de los embriones obtenidos. Además, observamos que el origen de los ovocitos que se emplean para un protocolo de producción in vitro (PIV) de embriones también influye en el efecto de AAL. Teniendo en cuenta los datos obtenidos, se sugiere que la suplementación con AAL en el medio de CIV durante la fase de MAGE podría dar resultados promisorios en un protocolo de OPU-PIV, representando no solo un aporte al conocimiento sino además una apuesta por mejorar las biotecnologías reproductivas.